|
Цель проекта - повышение качества лабораторной
диагностики туберкулеза в Российской Федерации. Эта цель может быть
достигнута за счет использования фтизиобактериологическими лабораториями
высококачественных стандартных питательных сред промышленного
изготовления для выделения и определения лекарственной чувствительности
M.tuberculosis.
В последнее десятилетие в России заболеваемость
туберкулезом увеличилась более, чем в два раза. Возрастает число случаев
туберкулеза, вызванных микобактериями, устойчивыми к
противотуберкулезным препаратам. В настоящее время в России примерно у
20% впервые выявленных больных обнаруживают лекарственноустойчивые
микобактерии. На фоне прогрессирования заболеваемости туберкулезом
отмечается снижение эффективности лабораторной диагностики.
В
условиях экономического кризиса при сокращении числа массовых
флюорографических обследований резко возрастает приоритетность
бактериологических методов диагностики.
Эффективность
бактериологических методов в большей степени определяется качеством
используемых питательных сред. Для выделения M.tuberculosis большинство
микобактериологических лабораторий за рубежом используют коммерческие
среды. Коммерческие среды более стандартны, чем среды лабораторного
изготовления. Их использование позволяет стандартизовать методы
микобактериологических исследований, повысить их качество и надежность.
В России фтизиобактериологические лаборатории в основном используют
питательную среду Левенштейна-Йенсена лабораторного изготовления,
приготовленную небольшими партиями часто без соответствующего
микробиологического контроля на тест-штаммах. Среда Левенштейна-Йенсена,
рекомендованная ВОЗ и Минздравом РФ для обязательного использования во
всех фтизиобактериологических лабораториях, в России применяется в
нескольких модификациях, отличных от оригинала, принятого во всем мире.
В связи с вышесказанным одной из задач по совершенствованию диагностики
туберкулеза является стандартизация питательных сред для выделения
микобактерий, которая может быть решена при промышленном изготовлении
питательной среды Левенштейна-Йенсена строго определенного состава. Ее
использование позволит выявить большее число случаев туберкулеза.
Другой важный этап бактериологической диагностики туберкулеза
заключается в определении чувствительности возбудителя к
противотуберкулезным препаратам, необходимой для выбора рациональной
химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения
прогноза заболевания.
Определение лекарственной чувствительности
микобактерий с помощью рутинных методов (метод абсолютных концентраций,
метод пропорций, метод относительной резистентности), основанных на
подсчете выросших колоний микобактерий на питательных средах, содержащих
противотуберкулезные препараты длительно (21-28 дней) и трудоемко.
Широкое распространение находит радиметрический метод, положенный в
основу автоматизированных систем типа ВАСТЕС, позволяющий уже через
неделю получить данные о лекарственной чувствительности выделенных
штаммов.
В сложившихся условиях экономического кризиса в России в
ближайшие годы вряд ли удастся оснастить все фтизиобактериологические
лаборатории аппаратурой подобного типа. Одним из этапов решения проблемы
повышения качества определения лекарственной чувствительности может
стать обеспечение лабораторий готовыми стандартными питательными средами
промышленного изготовления, содержащими противотуберкулезные препараты.
Наиболее удобно это осуществить при помощи набора питательных сред с
перечнем наиболее широко используемых противотуберкулезных препаратов,
рекомендованных ВОЗ.
В рамках данного проекта планируется
разработать технологию производства набора питательных сред
(тест-набора), состоящего из 7 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена с
нитратом натрия или калия, четыре из которых будут дополнительно
содержать противотуберкулезные препараты: изониазид, рифампицин,
стрептомицин, этамбутол. Две пробирки - с салицилатом натрия и
тиофенкарбоксилгидразидом (ТСН), необходимы для первичной идентификации
микобактерий. Седьмая пробирка - контрольная, без препарата. В основу
действия этого набора будет положен модифицированный метод абсолютных
концентраций, предложенный сотрудниками Центрального
научно-исследовательского института туберкулеза РАМН (ЦНИИТ). Через
10-12 дней инкубации в каждую засеянную пробирку, в которой еще
отсутствует визуально обнаруживаемый рост микобактерий, вносят индикатор
- реактив Грисса. Этот метод заключается в регистрации нитратредуктазной
активности штаммов M.tuberculosis. При наличии роста культуры
M.tuberculosis происходит изменение окраски среды. При отсутствии роста
(в случае чувствительной культуры) изменение окраски среды не
происходит. Уникальность создаваемого тест-набора заключается в том, что
с его помощью можно одновременно провести первичную идентификацию и
определение лекарственной чувствительности выделенных штаммов
M.tuberculosis, причем почти на 2 недели раньше, чем при использовании
традиционных методик. Набор не трудоемок в использовании, не требует
дополнительного оборудования и специальной подготовки персонала, и что
не мало важно, дешев, а по времени определения лекарственной
чувствительности приближается к автоматизированным системам ВАСТЕС.
Следовательно, совершенно очевидно, что использование во
фтизиобактериологических лабораториях разработанных в рамках проекта
набора питательных сред для первичной идентификации и определения
лекарственной чувствительности M.tuberculosis (тест-набора) и среды
Левенштейна-Йенсена строго определенного состава, разлитой в пробирки и
готовой к употреблению, позволит повысить выявляемость микобактерий
туберкулеза, ускорить определение лекарственной чувствительности,
увеличить надежность получаемых результатов, а также даст возможность
получать сравнимые данные по регионам для точной оценки эпидемической
ситуации.
Основными этапами исследований является:
1. Разработка
технологии производства питательной среды Левенштейна-Йенсена (в
пробирках). Наработка лабораторных образцов; физико-химический контроль
(рН, прозрачность, цветность, прочность) и биологический контроль с
использованием музейных и клинических штаммов микобактерий (50 штаммов)
из коллекций Государственного института стандартизации и контроля
качества медицинских и биологических препаратов (ГИСК) им. Л.А.
Тарасевича (г. Москва), ЦНИИТ (г. Москва), ГНЦПМ (Оболенск) по следующим
показателям: чувствительность, скорость роста, стабильность
культурально-морфологических свойств и ингибирующие свойства по
отношению к микрофлоре, вызывающей респираторные заболевания (не менее
20 штаммов);
2. Наработка экспериментально-производственных образцов
среды Левенштейна-Йенсена и их клинические испытания по выделению
микобактерий из клинического материала от больных туберкулезом на трех
экспериментальных базах Тульской, Калужской, Саратовской областей (не
менее 50 положительных находок на каждой базе);
3. Разработка
лабораторной технологии изготовления набора питательных сред для
первичной идентификации и определения лекарственной чувствительности
M.tuberculosis (тест-набора), наработка лабораторных образцов
тест-набора;
4. Лабораторное изучение тест-набора с использованием
музейных и клинических штаммов M.tuberculosis (50 штаммов, в том числе
лекарственноустойчивые) по следующим показателям: чувствительность;
скорость первичной идентификации и определения лекарственной
чувствительности M.tuberculosis; специфичность тест-набора с
использованием музейных и клинических штаммов микобактерий
M.tuberculosis, M.bovis, M.fortuitum, M.kansassii, M.smegmatis, M.avium,
M.intracellulare (всего 50 штаммов, включая лекарственноустойчивые), а
также музейных штаммов микроорганизмов, вызывающих респираторные
заболевания, Streptococcus pneumoniae, S.pyogenes, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Candida albicans,
Klebsiella pneumoniae (не менее 20 штаммов); ингибирующие свойства в
отношении штаммов, вызывающих респираторные заболевания;
5. Сравнение тест-набора со стандартным методом абсолютных
концентраций в определении лекарственной чувствительности клинических
штаммов M.tuberculosis (50 штаммов);
6. Разработка
экспериментально-производственной технологии изготовления тест-набора,
наработка экспериментально-производственных образцов; клинические
испытания тест-набора по первичной идентификации и определению
лекарственной чувствительности культур M.tuberculosis, выделенных от
больных туберкулезом, на трех экспериментальных базах Тульской,
Калужской, Саратовской областях (не менее 200 штаммов на каждой базе).
Ожидаемые результаты:
1. Будет разработана технология
производства среды Левенштейна-Йенсена (в пробирках) и нарботаны
лабораторные образцы (1000 пробирок) и экспериментально-производственные
образцы (2000 пробирок);
2. Будут получены данные о лабораторных и
клинических испытаниях среды Левенштейна-Йенсена (в пробирках) по
выделению микобактерий туберкулеза из клинического материала от больных
туберкулезом в трех экспериментальных регионах России;
3. Будет разработана технология производства набора питательных
сред для первичной идентификации и определения лекарственной
чувствительности M.tuberculosis (тест-набора), состоящего из 7 пробирок
со средой Левенштейна-Йенсена с нитратом натрия или калия, из которых 6
пробирок дополнительно содержат салицилат натрия,
тиофенкарбоксилгидразид, изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол
плюс 1 пробирка без препарата, и изготовлены лабораторные образцы (1000
тест-наборов) и экспериментально-производственные образцы (2000
тест-наборов);
4. Будут получены данные о лабораторном изучении тест-набора с
использованием музейных и клинических штаммов M.tuberculosis из
коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, ЦНИИТ и ГНЦПМ;
5. Будут получены
сравнительные данные по определению лекарственной чувствительности
клинических шатаммов M.tuberculosis с помощью тест-набора и стандартного
метода абсолютных концентраций;
6. Будут получены данные о
клинических испытаниях тест-набора по первичной идентификации и
определению лекарственной чувствительности культур M.tuberculosis,
выделенных от больных туберкулезом, в трех экспериментальных регионах
России;
7. Полученные данные будут использованы при оформлении
проекта научно-технической документации (временная фармакопейная статья,
экспериментально-производственный регламент, инструкция по применению)
на производство среды Левенштейна-Йенсена (в пробирках) и набора
питательных сред для первичной идентификации и определения лекарственной
чувствительности M. tuberculosis (тест-набора) для представления в
Фармакопейный комитет Российской Федерации.
Исследования по
разработке технологии производства питательных сред будут проводиться на
базе ГНЦ ПМБ Б (Оболенск), где организовано производство
бактериологических питательных сред более 60 наименований.
Производственные мощности расположены на площади в 10 000 м2. На
предприятии налажен выпуск как сухих, так и готовых к употреблению
питательных сред. Объем производства составляет 60 т сухих питательных
сред в год. Производство организовано и осуществляется в соответствии с
принципами GMP для лекарственных средств, основными из которых являются
высокая культура производства, контроль за качеством продукта на каждой
стадии его получения.
Участники проекта имеют опыт работы по созданию питательных сред для
широкого круга микроорганизмов, в т.ч. для возбудителей особоопасных
инфекций, по осуществлению физико-химического и бактериологического
контроля их качества, по организации промышленного производства.
Бактериологический контроль разрабатываемых питательных сред с
использованием музейных и клинических штаммов микобактерий будет
осуществляться сотрудниками отдела микробиологии ЦНИИТ и отдела
молекулярной биологии ГНЦ ПМБ Б , которые имеют опыт работы с
возбудителем туберкулеза, приобретенный при выполнении предыдущего
проекта в рамках МНТЦ "Молекулярно-биологический и иммунохимический
анализ клинических штаммов возбудителей туберкулеза и микобактериозов"
(N 810).
Основные результаты исследований, проводимых участниками проекта,
опубликованы в научных журналах (перечень которых приведен ниже).
1. Домотенко Л.В., Логачева Л.В., Шепелин А.П. Питательные
среды для диагностики дисбиотических состояний /Клиническая лабораторная
диагностика. 1997.-N 6. – с.63.
2. Шепелин А.П., Домотенко Л.В.,
Логачева Л.В., Мартовецкий М.Н., Шемякин И.Г. Организация производства
питательных сред для диагностики туберкулеза. // Тезисы докладов VI
Российского национального конгресса “Человек и лекарство” 19-23 апреля
1999 г, Москва, 1999 г. –с. 345.
3. Булатова Р.Ф., Шепелин А.П.,
Волков В.Я. Новые подходы в разработке критериев оценки качества сухих
питательных сред / Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - N 6. –
с.61-62.
3. Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярно-биологические
аспекты изучения возбудителя туберкулеза – Micobacterium tuberculosis
/Туберкулез и экология. 1997. - N 2. – с. 36-42.
4. Степаншин Ю.Г.,
Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Нетуберкулезные микобактерии:
лекарственная устойчивость и эпидемиология. // Новости науки и техники/
Серия: Медицина. Выпуск: Туберкулез. 1998. -N 5. – с. 1-8.
5.
Stepanshina V.N., Panfertsev E.A., Korobova O.V., Shemyakin I.G. et al.
Drug resistant strains of M.tuberculosis isolated in Russia /Int. J.
Tuberc. Lung. Dis. 1999.- v.3 (1). - p. 149-152.
6. Степаншин Ю.Г.,
Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости
Micobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам /Антибиотики и
химиопрепараты. 1999.-т. 44 (4). – с. 39-43.
7. Голышевская В.И.,
Корнеев А.А., Черноусова Л.Н. и др. Применение новых микробиологических
технологий в диагностике туберкулеза. /Проблемы туберкулеза. 1996. -N 6.
с. 22-25.
8. Корнеев А.А., Голышевская В.И., Севастьянова Э.В. и др.
использование нативной и лиофилизированной сред Левенштейна-Йенсена для
определения лекарственной устойчивости Micobacterium tuberculosis.
/Проблемы туберкулеза. 1999. -№ 4. – с. 25-27.
Взаимодействие с
коллабораторами в лице Ph.D. T. Shinnick и Dr. B. Metchock и партнером в
лице Ph.D. P. Henry проекта будет заключаться в обмене результатами
исследований, штаммами и осуществлении совместных экспериментальных
работ, а также в организации и проведении рабочих конференций и
семинаров, в подготовке публикаций.
В соответствии с целями МНТЦ при выполнении настоящего проекта
будут в полной мере реализованы такие задачи, как поддержание
фундаментальных и прикладных исследований. Данный проект позволит
использовать высококвалифицированных научных сотрудников, ранее
работавших по разработке средств и методов противобиологической защиты,
а также занимаемые ими рабочие помещения и лабораторное оборудование,
для решения задач здравоохранения. |
