|
Основной целью проекта является изучение особенностей
структурно-функциональной организации липополисахаридов (ЛПС) Y. pestis
и роли их детоксицированных производных в формировании протективного
противочумного иммунитета, индуцируемого при совместном введении с
белковыми FI и/или V антигенами.
В работах российских и зарубежных авторов показана важная роль
эндотоксического шока в патогенезе чумы [Дмитровский, 1994]. ЛПС
присутствует в R-форме у большинства вирулентных и авирулентных штаммов
Y.pestis. По ряду физико-химических, но не иммунохимических свойств ЛПС
Y.pestis близок к таковым глубоких Rc-Rd вариантов других
Enterobacteria. Серологическая специфичность ЛПС Y.pestis определяется
его коровой частью [Боровикова., 1972, Тараненко и др. 1985], и в
значительной степени зависит от температуры выращивания клеток
[Гремякова и др., в печати]. Чумной ЛПС обладает уникальной
иммунохимической специфичностью, отличной от коровой части ЛПС
Escherichia и Salmonellae. [Гремякова и др., 1997]. Показано также
изменение чувствительности клеток чумного микроба к R-ЛПС специфическим
фагам энтеробактерий в зависимости от температуры культивирования
клеток.
Иммунизация R-гликолипидом Y.pestis эффективна только при
использовании адъювантов и защищает мышей от заражения небольшими дозами
клеток вирулентного штамма чумного микроба [Тараненко и др., 1992].
Детоксикация чумного ЛПС деацилированием усиливает его протективные
свойства [Беспалова и др., 1995]. Противоречие между важной ролью в
патогенезе и столь незначительной протективной активностью чумного ЛПС
можно объяснить двумя причинами. Во-первых, в этих опытах использовали
препараты ЛПС, выделенные из культур штамма ЕВ, выращенных при 26 С,
тогда как если исходить из наших последних данных, иммунохимическая
специфичность препаратов ЛПС, выделенных из культур, выраженных при
различных температурах, существенно различается. Во-вторых, ввиду того,
что ЛПС чумного микроба представляет собой по сути низкомолекулярный
гаптен, он не способен сам по себе индуцировать напряженный иммунитет.
Ситуация меняется, когда иммунизацию проводят липополисахаридами
совместно с белками. Комплексирование R-липополисахаридов или их
детоксицированных производных с белками синергидно усиливает
иммуногенность обоих компонентов, меняет способ презентации белкового
антигена, индуцирует CTL ответ, стимулирует развитие более раннего и
продолжительного иммунитета.
Использование препаратов ЛПС в
медицинской практике до последнего времени осложнялось из-за токсичности
и пирогенности липида А. Разработанные в последние годы химические
методы детоксикации позволили с успехом применять нетоксичные аналоги
ЛПС при конструировании вакцин нового поколения, а также в клинической
медицине [Schneerson et al., 1991, Gustafson et al., 1992, Carpati et
al., 1992, Friede et al., 1993, Zhou et al., 1993, Ravindranath et al.,
1994, Hoffman et al., 1994].
Химическая детоксикация ЛПС,
позволяющая получать дериваты, сохраняющие все положительные качества
ЛПС (адъювантность, индукция синтеза цитокинов, активация макрофагов и
др.,) и лишенные при этом пирогенности и токсичности, делает возможным
использование их в качестве иммуноадъювантов низкоиммуногенных протеинов
[Johns, 1987, Albizo et al., 1995]. Химическая детоксикация ЛПС приводит
к получению двух типов дериватов. В случае кислотного дефосфорилирования
получаются препараты, аналогичные исходному ЛПС по молекулярной массе и
физико-химическим свойствам. Щелочное деацилирование приводит к
получению низкомолекулярных хорошо растворимых полисахаридов с небольшим
содержанием амидосвязанных жирных кислот.
Нашими недавними
исследованиями показано, что протективность капсульного FI антигена
Y.pestis в ранние сроки после иммунизации можно существенно повысить
комплексированием его с детоксицированным монофосфорил Липидом А или
использованием FI антигена с повышенным содержанием ЛПС [Гремякова и
др., 1994, 1995]. Антитела к FI антигену в этом случае определяются в
сыворотках иммунных животных уже на третьи сутки иммунизации, тогда как
при иммунизации вакциной ЕВ или очищенным антигеном – только на седьмые
сутки. V антиген Y. pestis, выходящий в настоящее время на первое место
среди чумных протективных белковых антигенов, способен индуцировать
напряженный протективный иммунитет только после нескольких иммунизаций с
сильным адъювантом [Nakajama et al., 1995, Motin et el., 1994].
Использование детоксицированных, но иммунологически активных модификаций
чумных ЛПС в виде липопротеиновых комплексов с FI и V антигенами или
гликопротеиновых конъюгатов с теми же антигенами будет способствовать не
только повышению протективности этих белков, формированию более
длительного клеточного иммунитета и обеспечению защиты от чумы в более
ранние сроки после иммунизации за счет активации макрофагального звена
иммунитета, но и индукции эффективного специфического протективного
антиэндотоксического иммунитета.
Для достижения поставленной цели
предполагается:
· провести электрофоретический и фаговый скрининг
музейных штаммов Y. pestis;
· определить природу и особенности
температуро-опосредованных изменений ЛПС чумного микроба;
·
определить химическую первичную структуру чумного ЛПС, выявить его
компоненты, обладающие протективными и иммуномодулирующими свойствами;
· получить банк моноклональных антител к ЛПС антигену;
· провести
эпитопный анализ ЛПС чумного микроба;
· провести сравнительный
иммунохимический анализ ЛПС чумного микроба;
· изучить особенности
взаимодействия иммунных сывороток от животных реконвалесцентов с
различными ЛПС чумного микроба;
· выбрать компоненты и модификации
ЛПС, перспективные для включения в состав белковых препаратов;
·
получить нетоксичные иммунохимически и биологически активные производные
чумного ЛПС (путем дефосфорилирования и деацилирования);
· создать
генетические конструкции для экспрессии V антигена в гетерологичных
штаммах и сконструировать рекомбинантные штаммы, синтезирующие V
антиген;
· выделить, очистить и охарактеризовать нативные препараты V
и FI антигенов;
· приготовить и охарактеризовать композиции ЛПС-белок;
· изучить
и выбрать наиболее эффективные комбинации антигенов;
· исследовать
особенности иммуногенеза полученных препаратов in vivo и in vitro;
·
составить заключение об эффективности изучаемых молекулярных композиций.
Работа, проведенная в рамках проекта, будет содействовать решению ряда
фундаментальных и прикладных вопросов, касающихся изучения молекулярной
биологии, патогенеза и иммунологии чумы. Эти исследования соответствуют
целям Международного научно-технического центра. Они будут
способствовать переориентации специалистов, ранее работавших по
оборонной тематике на решение фундаментальных и прикладных задач
медицины, а также их интеграции в международное научное сообщество. |
