Завершенные проекты 0402

Представленный рабочий план является результатом исследования, проведенного на стадии обоснования выполнимости проекта 402. Цели и задачи исследования были уточнены и обсуждены c иностранными коллабораторами и были одобрены ими. Выполненная работа привела нас к еще большему убеждению в важности и необходимости создания целого набора иммунотоксинов с различными механизмами действия для лечения новообразований простаты, являющихся в настоящее время одним из наиболее распространенных опухолевых заболеваний.
Целью проекта является создание рекомбинантных иммунотоксинов различного строения и обладающих различными механизмами действия. В связи с возможностью селекции опухолевых клеток, устойчивых к действию некоторых токсинов, для достижения этой цели нами были выбраны дифтерийный токсин (ДТ), ингибирующий синтез белка, и поверхностно-активный токсический тионин из Pyrularia pubera (PT), одним из полезных в данном случае свойств которого, как было показано, является неспособность вызывать иммунный ответ у мышей. В качестве мишени на нежелательных клетках нами был выбран поверхностный мембранный антиген простаты (prostate surface membrane antigen, PSM), являющийся трансмембранным гликопротеином и экспрессирующийся практически исключительно на клетках тканей простаты. Необходимость применения иммунотоксинов небольшого размера для проникновения в солидные опухоли была одной из причин конструирования рекомбинантных молекул с использованием наименьшей антигенсвязывающей единицы - так называемого одноцепочечного анти-PSM антитела (scFv). Показано, что процесс метастазирования при раке простаты - раннее событие. Клинические испытания продемонстрировали эффективность традиционных конъюгированных иммунотоксинов при уничтожении диссеминированных клетокмишеней благодаря их большим размерам и , как следствие, большим по сравнению с иммунотоксинами небольших размеров стабильности и времени жизни в сыворотке больных. Поэтому мы предполагаем создать слитые белки токсинстрептавидин (СА) для получения иммунотоксинов большого размера на основе биотинилированных анти-PSM антител или вариабельных доменов. Помимо этого гибридный белок дифтерийный токсин-стрептавидин (ДТСА) может быть использован для определения способности поверхностных антигенов опосредовать эндоцитоз.
Исследование будет проведено, как описано ниже. Предполагается получить гибридомные клетки, продуцирующие анти-PSM моноклональные антитела (МАТ), и определить их константы диссоциации как самих по себе, так и в составе иммунотоксинов. Предполагается клонировать ген ДТ, не имеющего рецептор-связывающего участка (ДТ389) ген СА, синтезированный ген РТ и гены анти-PSM scFv. Будут сконструированы рекомбинантные плазмиды, направляющие синтез гибридных белков ДТ389 scFv, PTscFv, ДТ389СА, РТСА и токсинов ДТзвд and РТ под контролем позднего промотора фага Т7. Экспрессированные в Escherichia coli и очищенные слитые белки на основе scFv и слитые белки токсин-СА, связанные с биотинилированными МАТ или их вариабельными областями, будут исследованы in vitro на селективную цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам, обладающим и не обладающим PSM.
Результатом настоящего исследования будет набор иммунотоксинов для лечения новообразований простаты, созданных с учетом данных литературы о клинических испытаниях переадресованных токсинов. Будет получена панель моноклональных антител к внеклеточной части PSM, который является привлекательной мишенью для уничтожения клеток рака простаты, и будут определены их константы связывания. Будет проведено сравнительное исследование на клетках рака простаты селективных цитотоксических свойств иммунотоксинов различной структуры и механизмов действия, сконструированных на основе токсина, ингибирующего синтез белка, и поверхностного токсического тионина Pyrularia pubera, а также анти-PSM scFv и МАТ или их вариабельных доменов.
Таким образом, в результате предлагаемого исследования будет создана панель рекомбинантных иммунотоксинов, отличающихся структурой и механизмом действия, для лечения одного из самых распространенных опухолевых заболеваний рака простаты.